WB抗體關(guān)鍵選擇要點：

特異性：優(yōu)先選擇經(jīng)過WB驗證的抗體（說明書標(biāo)注“WB-verified"），避免交叉反應(yīng)。

種屬匹配：目標(biāo)蛋白若為人類蛋白，優(yōu)先選抗人源抗體；一抗與二抗來源需對應(yīng)（如兔源一抗→山羊抗兔二抗）。

標(biāo)記類型：HRP偶聯(lián)二抗適合化學(xué)發(fā)光檢測，熒光標(biāo)記二抗適合熒光成像系統(tǒng)。

效價：抗體稀釋比需參考說明書，過高濃度易導(dǎo)致背景過高，過低則信號弱。

WB抗體使用流程與注意事項：

常規(guī)使用步驟：

蛋白樣品電泳分離→轉(zhuǎn)膜（將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜或PVDF膜）

封閉（5%脫脂奶粉或BSA，阻斷非特異性結(jié)合位點）

一抗孵育：4℃搖床過夜（推薦）或室溫孵育2-4h，之后用TBST洗膜3次

二抗孵育：室溫?fù)u床孵育1-2h，TBST洗膜3次

信號檢測（化學(xué)發(fā)光底物顯影或熒光掃描）

常見問題與解決方法：

無信號：抗體濃度過低、孵育時間不足、轉(zhuǎn)膜失敗→提高抗體濃度、延長孵育時間、優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件。

背景過高：封閉不充分、抗體濃度過高→延長封閉時間、降低抗體濃度、增加洗膜次數(shù)。

條帶雜帶多：抗體特異性差→更換經(jīng)過WB驗證的高特異性抗體，或增加一抗稀釋比。

抗體的保存與穩(wěn)定性：

未稀釋抗體：通常分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；部分抗體需4℃短期保存。

稀釋后工作液：4℃保存不超過1周，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

避免抗體接觸疊氮鈉（NaN?）：疊氮鈉會抑制HRP活性，若封閉液含NaN?，需洗膜后再孵育HRP偶聯(lián)二抗。