免疫組化染色（石蠟切片）實驗流程

A. 溶液和試劑

1. 二甲苯。

2. 不同濃度酒精。

3. 去離子水 (dH2O)。

4. 洗滌緩沖液：

a. 0.01 M PBS 緩沖液（pH7.2-7.4）：Na2HPO4•12H2O 3.63 g，KH2PO4 0.24 g ，NaCl 8.0g，KCl 0.2 g，加純凈水定容至 1000mL。

5. 抗體修復劑的選擇：

a. 0.01 M,pH 6.0 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液：

A 液： 0.1 mol/L 檸檬酸溶液（21.01 g 檸檬酸+純凈水至 1000 mL）

B 液：0.1 mol/L 檸檬酸鈉溶液（29.41g 檸檬酸鈉+純凈水至 1000ml）。

工作液：取 A 液 9 mL、B 液 47 mL 加純凈水定容至 500 mL。

b. EDTA 修復液（1 mM EDTA/10 mM Tris，pH 9.0）：原液：50x EDTA 修復液（30.3 gTris+9.3 g EDTA-2Na+12 mL 1 mol/L HCl，加純凈水至 500 mL）；工作液：1x EDTA修復液取 30 mL 原液加純凈水定容至 1500 mL。

6. 3% *：要制備 100 mL 溶液，將 10 mL 30% H2O2 加入到 90 mL dH2O 中。

7. 封閉液：1X PBS/10% 正常山羊血清：將 1 mL 正常山羊血清加入到 9 mL 1X PBS 中。

8. 檢測系統(tǒng)：兔二步法試劑盒（兔聚合物法檢測系統(tǒng)） (PV6001，ASGB-BIO)。小鼠二步法試劑盒（小鼠聚合物法檢測系統(tǒng)）(PV6002，ASGB-BIO)。

9. 顯色試劑：DAB 顯色試劑盒（ZLI-9019，ASGB-BIO）。

10. 蘇木精：D005-2，南京建成生物工程研究所。

11. 中性樹膠：ZLI-9516，ASGB-BIO。

B. 脫蠟/水化

注：務必使切片在制作過程中始終保持濕潤狀態(tài)。

1. 脫蠟/水化步驟：

a. 將切片放入二甲苯的洗液中孵育 2 次，每次 15 分鐘。

b. 將切片放入 100% 乙醇中孵育 2 分鐘。

c. 將切片放入 95% 乙醇中孵育 2 分鐘。

d. 將切片放入 80% 乙醇中孵育 2 分鐘。

e. 將切片放入 70% 乙醇中孵育 2 分鐘。

2. 用 dH2O 清洗切片 2 次，每次 5 分鐘。

C. 抗原修復

1. 對于檸檬酸鹽：將盛有 0.01 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）的切片盒置入微波爐中，在組織修復前調(diào)至高檔火加熱至沸騰。將處理好的切片放入熱的修復液中，啟動微波爐，將微波爐調(diào)至中檔并持續(xù)加熱 15 分鐘（加熱時間可能會因某些抗原的特殊需要而適當延長至 20 分鐘；如出現(xiàn)此情況，需在實驗記錄中進行說明），這期間觀察切片盒若有水分損失，可直接加入修復液；修復完成后將切片盒從微波爐取出放置室溫冷卻。

2. 對于 EDTA 緩沖液：在不銹鋼高壓鍋中加入 1500 mL EDTA 緩沖溶液（pH 9.0），蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，鎖定但不加蓋氣閥，在玻片修復前加熱至沸騰。打開鍋蓋將裝有玻片的塑料染色架浸入熱的修復液中，蓋上高壓鍋蓋子鎖定并加蓋氣閥，加熱，待到氣閥升起后計時。

3 分鐘后，停止加熱，置于水槽中，打開水龍頭沖洗高壓鍋，待到將至室溫后打開蓋子，取出玻片架。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。

D. 染色

1. 用 dH2O 清洗切片三次，每次 5 分鐘。

2. 切片放入 3 % *水溶液中，孵育 10 分鐘。

3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

4. PBS 洗 1 分鐘×8 次。

5. 在每個切片上滴加 100–400 µL 選封閉液，在室溫下封閉 30 分鐘。

6. 傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗，37℃孵育 1 小時或 4℃過夜。

7. PBS 沖洗，8 分鐘×1 次。

8. 滴加 HRP 標記的二抗工作液，37℃孵育 20 分鐘。

9. PBS 洗 1 分鐘×8 次。

10. DAB 溶液顯色 3 分鐘；顯色時應在鏡下觀察切片以控制時間，顯微鏡觀察出現(xiàn)棕黃色改變并且顏色深度適當時即可終止顯色。

11. 蘇木精復染 4 分鐘，自來水洗，鹽酸酒精分化 2 秒，返藍 20-40 分鐘；

12. 脫水透明封片：無水乙醇 2 分鐘×2 次，二甲苯 5 分鐘×2 次，中性樹膠封片（封片過程中應避免氣泡的產(chǎn)生）。

13.顯微鏡下觀察并拍照記錄實驗結(jié)果。