細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟

A. 溶液和試劑

• 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)： Na2HPO4•12H2O 3.63 g， KH2PO4 0.24g ，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，加純水定容至 1000 mL，調(diào)節(jié) pH 至 7.2-7.4

• 4% 甲醛：使用新鮮溶液。

• 封閉液：添加來自與二抗相同物種的 1 mL 正常血清和 9 mL 1X PBS 中來制備 1XPBS /10% 正常血清緩沖液，儲存在 4°C。

• 0.3% Triton X-100： 30 µL Triton X-100 到 10 mL 1X PBS 中來制備 1X PBS /0.3% Triton X-100 緩沖液。使用新鮮溶液。

• 熒光素偶聯(lián)的二抗：使用對您的一抗宿主物種（例如兔子）具有反應(yīng)性的二抗。

B. 固定

1. 用 4％ 的甲醛將樣品覆蓋到 2–3 mm 的深度。

2. 讓樣本在室溫下固定 15 分鐘。

3. 用 PBS 漂洗 2 次，每次 5 分鐘。

C. 透化（選做步驟）

注：如果靶點(diǎn)蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)部，透化是必要的步驟。

1. 用 0.3％ 的 Triton X-100 將樣品覆蓋到 2–3 mm 的深度。

2. 讓樣本在室溫下透化 10 分鐘。

3. 用 PBS 漂洗 2 次，每次 5 分鐘。

D. 免疫染色

1. 在封閉液中室溫封閉樣本 30 分鐘。

2. 封閉時，用 1XPBS 制備一抗（建議的稀釋范圍可聯(lián)系上方顯示客服電話咨詢）。

3. 吸出封閉溶液，然后加入稀釋后的一抗。

4. 4°C 溫度下孵育過夜。

5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分鐘。

6. 用 1X PBS 將熒光素偶聯(lián)的二抗稀釋后，37°C 避光孵育 1 小時（最·佳條件應(yīng)在不同實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)。

7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分鐘，使其避光。

8. 使用帶有 DAPI 的熒光封固劑對樣本進(jìn)行復(fù)染封片

9. 顯微鏡下觀察成像。

10. 為了長期保存，請?jiān)?4°C 下避光保存樣品。

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