ELISA(酶聯(lián)免疫)實(shí)驗(yàn)步驟

雙抗夾心 ELISA

A.緩沖液

PBS:136.9 mM NaCl,10.1mM Na₂HPO₄,2.7mM KCl,1.8 mM KH₂PO4,pH 7.4,0.2μm過濾除菌。

洗滌緩沖液：PBS中加入0.05% Tween20,pH7.2-7.4,0.2μm過濾除菌

封閉緩沖液：洗滌緩沖液中加入2% BSA

稀釋緩沖液：洗滌緩沖液中加入0.1% BSA,pH7.2-7.4,0.2μm過濾除菌

底物溶液：為了達(dá)到最·佳的實(shí)驗(yàn)效果，推薦用新鮮的底物溶液

底物存儲(chǔ)液：10 mg/mLTMB(Tetramethylbenzidine)in DMSO

底物稀釋緩沖液：0.05M Na2HPO?and 0.025M citric acid,pH to 5.5

底物工作液：將250 μL底物存儲(chǔ)液加入25mL 底物稀釋緩沖液，再加入80μL0.75%H_?O?, 充分混勻

終止液：2NH₂SO?

B.孔板包被

1. 用PBS稀釋捕獲抗體至合適的濃度，將稀釋好的捕獲抗體加入酶標(biāo)板，100μL/孔；密封酶標(biāo)板，置于4℃孵育過夜。

2. 棄掉孔板中的液體，每孔加入300μL 洗滌緩沖液，然后棄掉洗滌緩沖液，重復(fù)3 次。最··后一次洗滌后，拍干酶標(biāo)板。

3. 每孔加入300μL 封閉緩沖液，室溫孵育1小時(shí)。

4. 重復(fù)步驟2。

C. 顯色

1. 將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品加入酶標(biāo)板，每孔100μL, 密封酶標(biāo)板，室溫孵育2 小時(shí)。

2. 棄掉孔板中的液體，每孔加入300μL 洗滌緩沖液，然后棄掉洗滌緩沖液，重復(fù)3次。 最·后一次洗滌后，拍干酶標(biāo)板。

3. 每孔加入100 μL 經(jīng)稀釋緩沖液稀釋的檢測抗體，密封后，室溫孵育1小時(shí)。

4. 重復(fù)步驟2。

5. 每孔加入200 μL 底物工作液，室溫孵育20分鐘(避光)。

6. 每孔加入50 μL 終止液，輕輕搖勻。

7. 立即將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀讀值——450nm。

D. 結(jié)果處理

1. 如果待測樣本OD 值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線最·高點(diǎn) OD 值，需將樣本進(jìn)行稀釋后重新測定。

2. 取標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照、樣本的平均光吸收值，減去空白對(duì)照的平均光吸收值，得到 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的光吸收校準(zhǔn)值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，校準(zhǔn)后的標(biāo)準(zhǔn)品光吸收值 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

間接 ELISA

A. 緩沖液

PBS:136.9 mM NaCl,10.1mM Na₂HPO4,2.7mM KCl,1.8 mM KH₂PO4,pH 7.4,0.2μm過濾除菌。

洗滌緩沖液：PBS 中加入0.05% Tween20,pH7.2-7.4,0.2μm過濾除菌

封閉緩沖液：洗滌緩沖液中加入2% BSA

稀釋緩沖液：洗滌緩沖液中加入0.1% BSA,pH7.2-7.4,0.2μm 過濾除菌

底物溶液：為了達(dá)到最·佳的實(shí)驗(yàn)效果，推薦用新鮮的底物溶液

底物存儲(chǔ)液：10 mg/mLTMB(Tetramethylbenzidine)in DMSO

底物稀釋緩沖液：0.05M Na2HPO?and 0.025M citric acid,pH to 5.5

底物工作液：將250 μL 底物存儲(chǔ)液加入25mL 底物稀釋緩沖液，再加入80 μL0.75% H?O?, 充分混勻

終止液：2NH₂SO?

B. 孔板包被

1. 用PBS稀釋抗原(如：蛋白)至合適的濃度，將稀釋好的抗原加入酶標(biāo)板，100μL/ 孔；密封酶標(biāo)板，置于4℃孵育過夜。

2. 棄掉孔板中的液體，每孔加入300μL洗滌緩沖液，然后棄掉洗滌緩沖液，重復(fù)3 次。最·后一次洗滌后，拍干酶標(biāo)板。

3. 每孔加入300μL封閉緩沖液，室溫孵育1小時(shí)。

4. 重復(fù)步驟2。

C. 顯色

1. 將稀釋后的抗體加入酶標(biāo)板，每孔100μL,  密封酶標(biāo)板，室溫孵育2小時(shí)。

2. 棄掉孔板中的液體，每孔加入300μL洗滌緩沖液，然后棄掉洗滌緩沖液，重復(fù)3次。 最·后一次洗滌后，拍干酶標(biāo)板。

3. 加入HRP標(biāo)記的二抗，每孔100μL, 室溫孵育1小時(shí)。

4. 重復(fù)步驟2。

5. 每孔加入200 μL 底物工作液，室溫孵育20分鐘(避光)。

6. 每孔加入50 μL 終止液，輕輕搖勻。

7.立即將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀讀值——450nm。

備注：同時(shí)做空白對(duì)照，加樣品稀釋液(不含抗體)。

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